История Свято-Пафнутьева монастыря неразрывно связана с разными этапами становления российской государственности, многие из серьезных исторических событий нашли отражение в летописи обители.
Через 117 лет, в 1586 году собор был почти полностью разобран, и на его месте по воле царя Федора Ивановича cтроительством Поваренной, Оружейной и Георгиевской башен монастыря руководил знаменитый архитектор Феодор Конь, автор сооружений Белого города в Москве, Смоленского кремля и Симонова монастыря.В кладке фундамента использовались блоки с росписью XV века.
Так фрагменты росписи Митрофана и Дионисия сохранись до нашего времени (они находятся в Центральном музее древнерусской культуры и искусства им. Прп. Андрея Рублева в Москве и Боровском филиале Калужского государственного областного краеведческого музея).В XVI века монастырь был окружён каменными стенами и укреплениями; обитель превратилась в сильную пограничную крепость. В это время строится и каменная трапезная с храмом во имя Рождества Христова. В 1523 году была построена звонница, которая в 1688 году заменена колокольней: по желанию её заказчика, князя К. О. Щербакова, она повторяет формы колокольни Высоко-Петровского монастыря в Москве.
В 1610 году монастырь был сожжен поляками. По окончании Смуты представители Свято-Пафнутиева монастыря участвовали в Земском Соборе 1613 года, грамоту которого об избрании на царство Михаила Романова подписал и Пафнутиевский архимандрит Иона. В начале 1660-х годов в Пафнутиево-Боровском монастыре некоторое время находился в заточении известный руководитель сторонников старой веры протопоп Аввакум, а в 1670-х в стенах монастыря, а позже и Боровского городского острога содержалась под стражей боярыня Феодосья Морозова (в иночестве Феодора, ум. 1675).
После никоновской реформы Боровский Пафнутиев монастырь стал приходить в упадок.
В 1923 году все имущество обители отошло Главмузею, но вскоре в нем разместили исправительную колонию, потом — сельхозтехникум.
При реставрационных работах 1960-х годов были извлечены 194 белокаменных блока. Из них на 29-ти сохранились фрагменты сюжетной и декоративной живописи, принадлежащей кисти Дионисия. Перед возвращением монастыря Русской Православной церкви комплекс принадлежал Боровскому краеведческому музею.
Монастырь был передан Православной Церкви и вновь открыт в марте 1991 года. В Рождественском соборе хранятся мощи основателя обители — преподобного Пафнутия Боровского.
В Смутное время монастырь оказался на пути польско-литовских захватчиков во главе со Лжедитрием II и стал ареной кровавых событий, в результате которых подвиг православных защитников обители просиял в веках, а город Боровск получил новый герб. События церковного раскола, мучительно переживаемые Церковью, также коснулись монастыря — главный идейный вдохновитель старого церковного порядка протопоп Аввакум дважды содержался под стражей в стенах Пафнутьевой обители. Расположение монастыря на пути армии «двунадесяти языков» под предводительством Наполеона в 1812 году повлекло за собой разграбление и частичное разрушение обители. Великая Отечественная война 1941-1945 гг. также оставила след в истории монастыря: он вновь был разрушен и разграблен, но сумел выстоять и возродиться. Эпоха советского периода оказала, пожалуй, самое негативное влияние на монастырь. После национализации обители и изгнания монахов в 1919 году, монастырь за тридцать с небольшим лет хозяйствования советской власти был превращен практически в руины. Начавшие в 60-х годах XX века восстановление обители реставраторы столкнулись со множеством трудностей: им пришлось заливать новые фундаменты, восстанавливать стены, реставрировать храмы и здания. Новейшая история Пафнутьевой обители началась в 1991 году с возвращения в монастырь иноков и возобновления регулярных богослужений.
В монастыре регулярно отправляются богослужения суточного круга, расписание служб публикуется в монастырской газете «Вестник», а также в сети «интернет» на монастырском сайте. Постоянными прихожанами обители являются жители гг. Боровска, Балабаново, Ермолино, Обнинска, многие паломники приезжают на богослужения из Москвы и других городов. При монастыре функционирует воскресная школа для детей, а также проводятся лекции для взрослых, совместный просмотр и обсуждение фильмов. В 2011 году при монастыре создано молодежное движение 
«Православная молодежная дружина Боровского края», которое объединяет молодых людей на идеалах служения обществу, служения ближнему. В летнее время монастырь принимает детские группы скаутов, а также группу молодых художников из Калужского художественного училища, осуществляющих практические занятия на местности. На протяжении трех последних лет монастырем проводится детский полевой палаточный православно-патриотический лагерь «Стратилатъ». В лагере ежегодно отдыхают более 40 детей. Начиная с 2011 года, на базе лагеря уже трижды проводился трехдневный слет православной молодежи «Пафнутьевград». Монастырь активно осуществляет издательскую деятельность – издаются детский журнал «Кораблик», еженедельник «Вестник», а также газета для учителей и родителей «Боровский просветитель», издается ряд книг просветительского характера. Круглогодично в монастыре проводятся экскурсии для паломников, работает библиотека и иконно-книжная лавка. Боровский монастырь является главным организатором ежегодных районных Пафнутьевских образовательных чтений – межприходского мероприятия, направленного на развитие духовно-нравственной культуры населения района. На престольные праздники (Рождество Пресвятой Богородицы и День памяти прп. Пафнутия Боровского) в монастыре проводится праздничная трапеза для всех прихожан и паломников.